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Il punto di vista del microbiologo: PCR e orientamenti futuri

Inviato il 16/03/06 ore 21:03 da aispep
Eziologia
Dott. Sandra Mazzoli
Centro MST, Azienda Sanitaria di Firenze


Le prostatiti croniche rappresentano uno dei problemi infettivi emergenti nei giovani maschi in età fertile in Italia: l’età media è confermata intorno ai 30-40 anni. Le caratteristiche principali sono rappresentate dal precoce inizio dei sintomi, dal fatto che i sintomi persistono per anni in pazienti relativamente giovani, dal possibile impatto di infezioni che il paziente può acquisire con l’inizio dell’attività sessuale e che determinano gravi sequele a lungo termine quali l’infertilità.

Le sindromi prostatiche sono uno dei maggiori problemi in Urologia e Microbiologia; solo il 5-14% dei pazienti presentano un’infezione batterica: le prostatiti batteriche acute sono rare e solo una piccola percentuale di pazienti con prostatite cronica mostra un'infezione da uropatogeni riconosciuti.

Teoricamente l’eziologia coinvolge l’intero gruppo di specie batteriche, aerobie ed anaerobie, i funghi e tutti i microrganismi cosiddetti “criptici” o “difficili da crescere”. Tra i microrganismi più frequentemente identificati nei materiali biologici dei pazienti spiccano Escherichia coli e molte delle Enterobacteriaceae: Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Serratia spp. ed inoltre, tra gli altri batteri Gram negativi, Pseudomonas aeruginosa. Tra i Gram positivi gli Enterococchi quali Enterococcus faecalis e tra gli Stafylococchi Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus. Ancora, i Corynebacterium spp. tra cui Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium group ANF, Corynebacterium seminale ed i batteri anaerobi.

Per il microbiologo esistono una quantità di difficoltà nell’interpretazione dei reperti microbiologici dei pazienti con prostatite: infatti, nei campioni biologici di origine profonda (Expressed Prostatic Secretion- EPS, urinocoltura, eiaculato totale), se non prelevati secondo un preciso protocollo, si ritrova spesso la presenza di microbiota indigeni contaminanti, derivanti principalmente dal passaggio attraverso l’uretra distale contaminata e colonizzata normalmente. Un altro problema di non poco conto, soprattutto quando si cercano microrganismi “difficili da crescere” o “criptici”, è la presenza di possibili sostanze inibenti nella secrezione di origine prostatica e nell’eiaculato totale. Questi pazienti inoltre, proprio per la ciclicità degli episodi di prostatite, sono soggetti a cicli multipli di antibiotico e farmaco terapia, che possono modificare la struttura e le caratteristiche stesse, anche colturali, dei microrganismi presenti.

Inoltre, sono spesso presenti microrganismi “difficili da coltivare”, mancanti o difettivi nella parete cellulare, modificati, e che spesso interagiscono con altri microrganismi e con l’ospite, con le sue difese immunitarie. Spesso molti di questi germi producono una matrice extracellulare che porta alla formazione di “Biofilms” che intrappolano batteri, cellule immunocompetenti, che le inattivano ed in cui i germi trovano il perfetto nascondiglio, diventando incoltivabili; in aggiunta si può avere uno stress ambientale nei tessuti, anch’esso capace di determinare una difficile ricognizione delle presenze microbiche. Da ciò deriva che diventano indispensabili media colturali specializzati, colorazioni speciali, Microscopia Elettronica e Polymerase Chain Reaction- PCR.

Nel 1983 Kary B. Mullis ricevette il premio Nobel per la scoperta di un metodo che ha segnato una vera e propria rivoluzione delle scienze moderne, metodo che, sfruttando un enzima termostabile, era in grado di polimerizzare il DNA. Questo metodo di PCR è stato applicato dagli anni 80 in poi anche alla diagnosi delle malattie infettive che partivano dall’identificazione dell’agente infettante nel materiale biologico del paziente: in questo caso la ricerca degli acidi nucleici batterici, micotici e virali si è sostituita alle colture e ne è derivata una modifica anche dei “Postulati di Kock”. Lo sviluppo delle tecniche di diagnostica biomolecolare ha portato ad una vera rivoluzione nell’approccio diagnostico consentendo soprattutto di avere un miglioramento sostanziale della sensibilità, l’accorciamento dei tempi di risposta, l’aumento del numero degli agenti infettanti rilevabili e l’applicabilità a campioni biologici cosiddetti “difficili”. Soprattutto per la PCR, la soglia di sensibilità si attesta tra 1 e 10 copie di DNA/RNA dei microrganismi presenti nel campione, contro la migliore altra sensibilità che si riferisce ai metodi di ibridazione in situ degli acidi nucleici, che non prevedono amplificazione del DNA target, e che si attestano nell’ordine delle 10.000-100.000 copie di acido nucleico.

Tutto ciò ha determinato l’avvento del nuovo approccio diagnostico microbiologico biomolecolare delle prostatiti. La PCR è la più sensibile tecnica per rilevare il DNA/RNA dei microrganismi. La PCR va utilizzata su tutti i materiali biologici possibilmente prelevabili dallo stesso paziente, in più steps diagnostici dallo stesso paziente e comunque la sua negatività non esclude la presenza di infezione.

Esiste un ben preciso razionale per la scelta della PCR che è possibile schematizzare in questi passaggi:
  • Possibilità di rilevamento del genoma batterico e virale in tutti i materiali biologici
  • Presenza di inibitori nei campioni biologici, soprattutto quelli provenienti dall’alto tratto genitale
  • Terapie antibiotiche preesistenti ed a lunga durata
  • Microrganismi non coltivabili - criptici o modificati
  • Microrganismi persistenti in fase dormiente, di latenza
  • Microrganismi contenuti in biofilms
  • Possibilità di utilizzo di regioni genomiche conservate (16s rRNA) e/o comuni a più microrganismi (TET resistance) per il loro rilevamento
  • Possibilità di confrontare i genomi amplificati con banche dati mondiali
  • Possibile monitoraggio e follow up post-terapia
I microrganismi anche detti “criptici” o “non coltivabili”, di fatto non isolabili, o non facilmente isolabili, su terreni standard per colture batteriche, sono evidenziabili con PCR: tra i Batteri, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Neisseria gonorrhoeae. Tra i Virus, HPV, Herpes virus 1, Herpes virus 2.

Tra i batteri, alcuni dei sopra citati sono parassiti intracellulari come i virus, e sono in grado di determinare infezioni cronico-persistenti e di sfuggire ai meccanismi di immunità cellulo-mediata e alle cellule immunocompetenti atte alla loro distruzione.

Dal 1995 nel Laboratorio del centro M.T.S. abbiamo iniziato ad applicare le tecniche di biologia molecolare in Polymerase Chain Reaction ai materiali biologici provenienti dal tratto genitale, superiore ed inferiore, di pazienti con prostatite. L’applicazione della PCR al rilevamento di Chlamydia trachomatis ha permesso di capire l’impatto del micro organismo in tale popolazione di pazienti. La prevalenza di infezione rilevata è passata dall’11,8% del 1995 al 36% del 2002, grazie soprattutto all’affinamento ed alla standardizzazione di tutte le fasi pre-PCR, ovvero di trattamento dei campioni “critici” e di estrazione del DNA microbico. Negli anni sono anche aumentati i microrganismi cui è stata applicata tale tecnologia di rilevamento ed in una recentissima statistica su 302 pazienti affetti da prostatite cronica afferenti al Centro MST ed alla U.O. di Urologia dell’Ospedale S. M. Annunziata (ASL 10 Firenze) dal 1° luglio 2002 al 31 giugno 2004, in cui sono stati analizzati con PCR tutti i materiali biologici presentati, includendo il materiale da massaggio prostatico, l’urina primo getto della notte, l’eiaculato totale e su cui sono state inoltre effettuate urinocoltura e spermiocoltura, la diagnostica biomolecolare ha permesso di diagnosticare microrganismi nel 66.5% dei casi, contro il 27,8% di positività delle colture convenzionali.

Dall’Aprile 2004 abbiamo aggiunto alla diagnostica su prostatiti la ricerca dei virus Herpes simplex 1 e 2. La casistica sotto riportata si riferisce ad una popolazione di 168 pazienti con prostatite cronica analizzata dall’Aprile al maggio 2004. Nelle prostatiti abatteriche spicca il ruolo dei virus e dei microrganismi criptici. Da valutare accuratamente in futuro il ruolo del rilevamento multiplo di microrganismi latenti (virus e batteri) nell’eziogenesi dell’infiammazione cronica, nelle prostatiti croniche, nell’infertilità e nel tumore prostatico. Nell’ultimo mese abbiamo iniziato la ricerca sistematica di Mycoplasma genitalium, che per le sue caratteristiche di difficilissima coltivabilità ha una prevalenza assolutamente sconosciuta in Italia nelle prostatiti e che invece è un importante agente di uretrite in vari paesi (U.K. 5%).

Per quanto concerne la diagnostica dei ceppi anogenitali di HPV da noi rilevati in pazienti con prostatite cronica l’utilizzo della PCR si è dimostrato un metodo molto efficace, anche applicato a materiali biologici atipici (Urine, Urine post massaggio prostatico e Sperma). I ceppi anogenitali di HPV sono in grado di dare non solo lesioni cutanee (condilomi), ma anche di infettare il tratto urogenitale medio-alto nei pazienti maschi con prostatite: la frequenza di infezione è alta, 32%.

L’utilizzo contemporaneo dei tre materiali biologici, è stato importante per localizzare la probabile sede dell’infezione, diagnosticare il 42% in più di positivi rispetto allo screening su un solo materiale, per i follow-up, in quanto la positività nei tre campioni analizzati per paziente non è stata costante ed ha dimostrato un’eliminazione discontinua del virus. I genotipi virali ad alto rischio oncogeno prevalentemente riscontrati sono stati il 16 ed il 18; è molto alta anche la percentuale di coinfezioni 16/18.

Sorge spontanea una considerazione e cioè che la dimostrazione dell’impatto di HPV nei materiali biologici di origine genitale nel maschio, soprattutto dei genotipi virali ad alto rischio oncogeno, deve spingerci verso un’attenzione ed una giusta prevenzione oncologica che fino ad ora è stata rivolta solo ed esclusivamente alle donne.

Ancora, l’utilizzo della PCR nella diagnostica delle prostatiti ci ha permesso di associare la presenza di Chlamydia trachomatis con l’infertilità in questi pazienti. Lo studio da noi svolto su più di 1000 pazienti con prostatite ha suggerito che Chlamydia può invadere la prostata, persistere anche dopo il trattamento antibiotico, determinare la presenza continua dei propri antigeni e dei propri acidi nucleici, indurre reazioni infiammatorie con produzione di sostanze immunomodulanti (Citochine), indurre produzione di anticorpi contro componenti cellulari comuni anche alle cellule umane (HSP60), già reperiti come significativi nell’infertilità femminile da Chlamydia trachomatis. Inoltre, la persistenza degli antigeni chlamydiali e la grande quantità di anticorpi prodotti, non capaci di neutralizzare l’infezione silente, marcata dalla DNA positività continua nel tempo, porterebbero alla formazione di immunocomplessi al sito di infezione e all’accumulo e stimolazione di cellule infiammatorie ed a danno e distruzione del tessuto prostatico.

In conclusione, quello che attualmente abbiamo a disposizione è una diagnostica raffinata, multiparametrica, uno stretto follow up del paziente ed un trattamento farmacologico variegato, anche se non sempre efficace. Nel futuro le tecniche biomolecolari, sempre più aggiornate, permetteranno di:
  • Monitorare quantitativamente queste infezioni
  • Tipizzare i microrganismi fino al biotipo al fine di valutare se presenti reinfezioni (endogene o esogene) o nuove infezioni ed ai fini epidemiologici
  • Valutare l’antibiotico resistenza in microrganismi non coltivabili
  • Valutare l’antibiotico resistenza in microrganismi coltivabili (rapidità di risposta)
  • Effettuare la valutazione delle resistenze neoindotte da terapia (Follow-up)
  • Valutare della presenza dei microrganismi in siti biologici associabili all’infezione primaria
  • Valutare microrganismi ancora poco associati alla patologia ed alle sindromi ad essa correlate (Nanobatteri, Corynebatteri, Mycoplasmata, HHV-6, HHV-8, HERV)
Complessivamente, l’utilizzo di queste tecniche biomolecolari rappresenta un enorme passo avanti nella definizione di questa patologia, la prostatite, ancor oggi entità sconosciuta.
 
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